Page 7 - 《西北农业学报》2021年第11期
P. 7
11 期 王 耀等: 盐酸可乐定人工抗原及其鼠源多抗的制备 · 1 5 9 7 ·
SDS-PAGE 鉴定: 参照文献[ 19 ] 配制电泳所 马斯亮蓝染液染色 3~4h , 脱色液脱色 6h , 用凝
需浓缩胶和分离胶, 选择的浓缩胶和分离胶体积 胶成像仪拍照, 根据蛋白条带位置差异判断偶联
分数分别为 5% 和 12% , 电泳的电压分别为 60V 效果。
)。考
和 90V , 上样量为 10 μ L ( 含人工抗原 5 μ g
图 2 CLO-BSA 人工抗原合成路线
Fi g .2 S y ntheticrouteofartificialanti g enCLO-BSA
1.2.3 多 抗 的 制 备 与 鉴 定 用 合 成 的 免 疫 原 包被好的 ELISA 板, 首先每孔加入 100 μ L 不同
( CLO-BSA ) 免 疫 4 只 SPF 级 6 周 的 龄 雌 性 浓度梯度的 CLO 标 准 品 溶 液, 然 后 加 入 一 定 倍
BALB / c小鼠, 采用背部皮下多点注射方式进行 数稀 释 的 多 抗 ( 效 价 测 定 时 OD 450nm 为 1.2 左
免疫。首免为基础免疫, 用灭菌 PBS 稀释 CLO- 右), 在 37 ℃ 条件下孵育 15min 。其他操作步骤
BSA 后与 FCA 等体积混合, 用乳化器充分乳化 与多抗效价测定操作相同。以抑制率( B / B 0 为
)
后以每只 200 μ L ( 含免疫原 30 μ g 的剂量免疫小 纵坐标( 其中 B 为阳性孔的 OD 450nm B 0 为 CLO
)
,
鼠, 首免 21d后进行 3 次加强免疫, 每次间隔 21 ), 以 CLO 浓度的对数值为
浓度为零时的 OD 450nm
d , 其中免疫佐剂使用 FIA 代替 FCA 。在第 4 次 横坐标, 绘制标准抑制曲线, 最后根据抑制曲线获
免疫 10d后断尾采血, 用 PBS 稀释 100 倍, 离心 得的线性回归方程计算半数抑制质量浓度( Half
去除沉淀后, 以包被原( CLO-OVA ) 包被 ELISA ), 并 以 此 来 评 定 多
inhibitor yconcentration , IC 50
板鉴定其免疫学特性。 抗的敏感性。
多 抗 效 价 测 定:采 用 间 接 ELISA 方 法 多抗特 异 性 鉴 定: 选 择 PA 、 BA 、 SAL 、 RAC
( i-ELISA ) 测定多抗效价, 具体操作为: 首先将 等瘦肉精类药物作为竞争物, 采用ic-ELISA 法测
[ 20 ]
包被原 CLO-OVA 用 CBS 包被缓冲液稀释后每 。以 CLO 的IC 50 与各
定各竞争物对多抗的IC 50
孔 100 μ L 包被于96 孔 ELISA 板中, 在4℃ 条件 竞争物的 IC 50 的 百 分 比 作 为 交 叉 反 应 率 ( Cross
下包被过夜, 然后用 PBST 洗涤液洗板并甩干液 reactivit y CR% ), CR 越低, 则说明多抗的特异性
,
体, 最后每孔加入 250 μ L 封闭液在 37 ℃ 条件下 越强 [ 22 ] 。
封闭1h , 洗板甩干后于4℃ 保存, 备用。检测时, 1.3 数据处理
取包被好的 ELISA 板, 每孔加入 100 μ L 倍比稀 对所得的数据利用 Excel进行处理并绘图,
释的多抗, 以小鼠阴性血清为阴性对照, PBS 为 对分子 结 构 式 及 合 成 路 线 图 用 ChemDraw Pro
空白对照, 在 37 ℃ 条件下孵育 15min ; 洗板甩干 18.0 进行绘制。
后加入用封闭液稀释 1000 倍的 HRP 标记的羊
抗鼠I g G , 37 ℃ 条件下孵育 30 min ; 洗板后每孔 2 结果与分析
加入 100 μ L 显 色 液 ( TMB ), 室 温 避 光 显 色 10 2.1 人工抗原鉴定
min , 最后加 100 μ L 终止液 终 止 反 应, 用 酶 标 仪 2.1.1 紫外扫描鉴定结果 采用重氮化法合成
CLO 人工抗原, 用紫外扫描法鉴定其偶联效果,
读取 OD 450nm 。阳性判定标准为: 待测孔 OD 450nm
大于 0.2 , 并大于空白孔 OD 450nm 的 2.1 倍。以阳 结果如图 3 所示。从紫外扫描图谱中可以看出,
性孔最小 OD 450nm 所对应的多抗稀释倍数作为效 BSA 和 OVA 在 280nm 处左右有明显的特征吸
价。 收峰, CLO 在 225nm 和 270nm 处 出 现 特 征 吸
多抗敏感性鉴定: 采用间接竞争 ELISA 方法 收峰, 而 合 成 的 人 工 抗 原 ( CLO-BSA 和 CLO-
( ic-ELISA ) 鉴定多抗敏感性, 具体操作 为: 取 OVA ) 的特征吸收峰相比载体蛋白和 CLO 均发
[ 21 ]