Page 7 - 《西北农业学报》2021年第11期
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11 期                      王   耀等: 盐酸可乐定人工抗原及其鼠源多抗的制备                                ·  1 5 9 7 ·

                 SDS-PAGE 鉴定: 参照文献[ 19 ] 配制电泳所                马斯亮蓝染液染色 3~4h , 脱色液脱色 6h , 用凝
              需浓缩胶和分离胶, 选择的浓缩胶和分离胶体积                          胶成像仪拍照, 根据蛋白条带位置差异判断偶联
              分数分别为 5% 和 12% , 电泳的电压分别为 60V                   效果。
                                                    )。考
              和 90V , 上样量为 10 μ L ( 含人工抗原 5 μ g












                                              图 2 CLO-BSA 人工抗原合成路线
                                        Fi g .2 S y ntheticrouteofartificialanti g enCLO-BSA
             1.2.3  多 抗 的 制 备 与 鉴 定   用 合 成 的 免 疫 原           包被好的 ELISA 板, 首先每孔加入 100 μ L 不同
              ( CLO-BSA ) 免 疫 4 只 SPF 级 6 周 的 龄 雌 性           浓度梯度的 CLO 标 准 品 溶 液, 然 后 加 入 一 定 倍
             BALB / c小鼠, 采用背部皮下多点注射方式进行                       数稀 释 的 多 抗 ( 效 价 测 定 时 OD 450nm 为 1.2 左
              免疫。首免为基础免疫, 用灭菌 PBS 稀释 CLO-                     右), 在 37 ℃ 条件下孵育 15min 。其他操作步骤
             BSA 后与 FCA 等体积混合, 用乳化器充分乳化                       与多抗效价测定操作相同。以抑制率( B / B 0 为
                                                                                                      )
              后以每只 200 μ L ( 含免疫原 30 μ g 的剂量免疫小               纵坐标( 其中 B 为阳性孔的 OD 450nm B 0 为 CLO
                                            )
                                                                                               ,
              鼠, 首免 21d后进行 3 次加强免疫, 每次间隔 21                                       ), 以 CLO 浓度的对数值为
                                                              浓度为零时的 OD 450nm
             d , 其中免疫佐剂使用 FIA 代替 FCA 。在第 4 次                  横坐标, 绘制标准抑制曲线, 最后根据抑制曲线获
              免疫 10d后断尾采血, 用 PBS 稀释 100 倍, 离心                 得的线性回归方程计算半数抑制质量浓度( Half

              去除沉淀后, 以包被原( CLO-OVA ) 包被 ELISA                                           ), 并 以 此 来 评 定 多
                                                             inhibitor yconcentration , IC 50
              板鉴定其免疫学特性。                                      抗的敏感性。
                  多 抗 效 价 测 定:采 用 间 接 ELISA 方 法                   多抗特 异 性 鉴 定: 选 择 PA 、 BA 、 SAL 、 RAC
              ( i-ELISA ) 测定多抗效价, 具体操作为: 首先将                  等瘦肉精类药物作为竞争物, 采用ic-ELISA 法测
                       [ 20 ]
              包被原 CLO-OVA 用 CBS 包被缓冲液稀释后每                                            。以 CLO 的IC 50 与各
                                                              定各竞争物对多抗的IC 50
              孔 100 μ L 包被于96 孔 ELISA 板中, 在4℃ 条件              竞争物的 IC 50 的 百 分 比 作 为 交 叉 反 应 率 ( Cross
              下包被过夜, 然后用 PBST 洗涤液洗板并甩干液                      reactivit y CR% ), CR 越低, 则说明多抗的特异性
                                                                      ,
              体, 最后每孔加入 250 μ L 封闭液在 37 ℃ 条件下                 越强  [ 22 ] 。

              封闭1h , 洗板甩干后于4℃ 保存, 备用。检测时,                    1.3  数据处理
              取包被好的 ELISA 板, 每孔加入 100 μ L 倍比稀                     对所得的数据利用 Excel进行处理并绘图,
              释的多抗, 以小鼠阴性血清为阴性对照, PBS 为                       对分子 结 构 式 及 合 成 路 线 图 用 ChemDraw Pro
              空白对照, 在 37 ℃ 条件下孵育 15min ; 洗板甩干                18.0 进行绘制。
              后加入用封闭液稀释 1000 倍的 HRP 标记的羊
              抗鼠I g G , 37 ℃ 条件下孵育 30 min ; 洗板后每孔            2 结果与分析

              加入 100 μ L 显 色 液 ( TMB ), 室 温 避 光 显 色 10       2.1  人工抗原鉴定
             min , 最后加 100 μ L 终止液 终 止 反 应, 用 酶 标 仪          2.1.1  紫外扫描鉴定结果   采用重氮化法合成

                                                             CLO 人工抗原, 用紫外扫描法鉴定其偶联效果,
              读取 OD 450nm  。阳性判定标准为: 待测孔 OD 450nm
              大于 0.2 , 并大于空白孔 OD 450nm 的 2.1 倍。以阳             结果如图 3 所示。从紫外扫描图谱中可以看出,
              性孔最小 OD 450nm 所对应的多抗稀释倍数作为效                    BSA 和 OVA 在 280nm 处左右有明显的特征吸

              价。                                              收峰, CLO 在 225nm 和 270nm 处 出 现 特 征 吸
                  多抗敏感性鉴定: 采用间接竞争 ELISA 方法                    收峰, 而 合 成 的 人 工 抗 原 ( CLO-BSA 和 CLO-
              ( ic-ELISA ) 鉴定多抗敏感性, 具体操作 为: 取                 OVA ) 的特征吸收峰相比载体蛋白和 CLO 均发
                        [ 21 ]
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