Page 6 - 《西北农业学报》2021年第9期

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生物样品中的稳定性, 同时还考察了大鼠肠道菌 理盐水按比例( 1g ︰ 5 mL ) 涡旋混合制成悬浊
群对 DFB 的降解作用, 为后续的制剂设计和开发 液, 2000g 离心 10 min ( 4 ℃ ), 再将上清液与厌
提供理论参考。 氧培养液按比例( 1 ︰ 9 ) 混合, 置厌氧培养箱中过
夜, 制得肠道菌群培养液, 待用。
1 材料与方法
1.4.5 空白组织样品的制备 [ 24-26 ] 取 SD 大鼠
1.1 药品与试剂 ( 230~250g 6 只, 禁食不禁水过夜, 腹腔注射乌
)
除虫脲标 准 物 质 ( 中 国 计 量 科 学 研 究 院, 批 拉坦麻醉, 迅速处死, 取出肝脏、 胃、 小肠和大肠,
号: 19001 , 纯度 >99.8% ); 乌拉坦( NJKOCED ); 用预冷的磷酸盐缓冲液( 4 ℃ 预冷 2h ) 冲洗表面
,
胰 蛋 白 酶 ( 酶 活 250NFU / m g 索 莱 宝, 批 号: 后剪 碎, 再 将 各 组 织 与 磷 酸 盐 缓 冲 液 按 比 例
T8150 ); 胃蛋白酶( 酶活 3000~3500NFU / 索 ( 1g ︰ 5mL ) 混合, 置于匀浆机中均质后, 2000
g
莱宝, 批 号: P8390 ); 磷 酸 盐 缓 冲 液 ( 索 莱 宝, 批 g 离心 10min ( 4 ℃ ), 取上清液, 备用。上述操作
号: D1040-500 ); 厌 氧 培 养 基 ( CM1513 北 京 陆 均在冰浴条件下进行。
桥); 泊 洛 沙 姆 188 ( 索 莱 宝, 批 号: S7070 ); 乙 腈 1.4.6 厌 氧 培 养 基 的 制 备 称 取 厌 氧 培 养 基
( 色谱纯, Fisher ); 盐酸、 磷酸二氢钾、 氢氧化钠等 9.5g 加水 800 mL 摇匀, 然后加水稀释并定容
,
均为国产分析纯试剂。 到1000mL , 高压灭菌后分装到试管中, 制成厌
1.2 主要仪器 氧培养基( GAM ), 4 ℃ 保存, 备用。
超高效液相色谱仪 - 紫外检测器( DAD ), 安 1.5 色谱条件与方法学考察

捷伦 1290 ; 匀浆机( IKA-T25 ); 离心机( Multifu g e 1.5.1 色 谱 条 件 参 照 文 献 [ 27 ], 略 有 调 整。
X3R ); 厌氧培养箱( Thermo )。 Phenomenexluna C18 色 谱 柱 ( 150 mm ×4.6
1.3 试验动物 mm , 5 μ m ); 流动相( A ) 为 6.3g L 甲酸铵,( B )
/
6 只清洁级 SD 大鼠, 雄性, 8~10 周, 体质量 为乙腈, 等度洗脱( A 与 B 的体积比为40 ︰60 );
210~230g 购于中国农业科学院兰州兽医研究 进样时间 15min ; 柱温 30 ℃ ; 检测波长 254nm ;
,
所, 动物生产许可证号: NKMYD201907018 。 流速 1.0mL / min ; 进样量 10 μ L 。
1.4 溶液配制 1.5.2 方法学考察 方法专属性: 分别取空白人
1.4.1 储备液与溶液 称取除虫脲标准物质适 工胃液、 空白人工肠液、 人工胃液、 人工肠液、 人工
量, 以乙腈溶解制 成 质 量 浓 度 为 1 m g mL 的 储 胃液 +DFB 储备液、 人工肠液 + DFB 储备液、 空
/
备液, 于 4 ℃ 储备。使用前用乙腈稀释得到相应 白人工胃液 + DFB 储备液、 空白肠道菌液、 空白
质量浓度的对照品溶液。 肝液、 空白胃液、 空白大肠及其内容物、 空白小肠
1.4.2 人工胃液的制备 按文献[ 21 ] 的方法, 取 及其内容物。按照“ 1.5 ” 项下的样品处理方法操
稀盐酸( 取盐酸 234 mL , 加水稀释至 1000 mL ) 作后, 按“ 1.5.1 ” 项下的色谱条件进样分析, 对比
16.4mL , 加水约 800mL 与胃蛋白酶 10g 摇匀 色谱图。观察 BFD 标准品的出峰位置是否有其
,
后, 用3.65g L 盐酸溶液调 p H 至1.3 , 然后加水 他物质干扰。
/
稀释并定容至 1000mL , 即得人工胃液。空白人 精密度试验: 精密吸取 DFB 储 备 液 10 、 40 、
工胃液的配制: 除不含胃蛋白酶, 其余与人工胃液 100 μ g mL 各1 份, 在不同时间点( 0h 、 4h 、 8h 、
/
配制相同。 12h 、 24h ) 按照 “ 1.5.1 ” 项下条件进样分析, 记录
1.4.3 人工肠液的制备 按文献[ 21 ] 的方法, 取 峰面积。
,
磷酸二氢钾 6.8g 加水 500 mL 使其溶解, 用 4 重现性试验: 精密吸取 DFB 储 备 液 10 、 40 、
g L 氢氧化钠溶液调节 p H 至6.8 ; 称取胰蛋白酶 100 μ g mL 各 6 份, 再按“ 1.5.1 ” 项下进样 1 次,
/
/
10g 加适量水溶解; 将上述两种溶液混合后, 再 记录峰面积。
,
加水稀释并定容到 1000mL , 即得人工肠液。空 1.6 样品处理
白人工肠液的配制: 除不含胰蛋白酶, 其余与人工 1.6.1 人工胃 / 肠液样品处理 移取 DFB 储备
/
肠液配制相同。 液 4 份 ( 1 m g mL ), 每 份 500 μ L , 分 别 置 于
1.4.4 SD 大鼠肠道菌群的制备 [ 22-23 ] SD 大鼠 50mL 容量瓶中, 由于 DFB 的水溶性差, 在人工
禁食 12h 刺激腹部采集新鲜粪便。将粪便与生 胃、 肠液加入一定量的增溶剂泊洛沙姆 188 , 以增