Page 7 - 《西北农业学报》2021年第9期
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9 期 陶 琦等: 除虫脲在人工胃 / 肠液和肠道菌群及生物样品中的稳定性研究 · 1 2 7 3 ·
加 DFB 在样品中的溶解性, 然后分别用处理过的 间点的剩余百分比, 结果见图 2 。如图所示, 经过
空白人工胃液、 空白人工肠液、 人工胃液、 人工肠 6h 、 37 ℃ 孵育后, 在空白胃液、 人工胃液及空白
液稀释并定容, 充分混匀后, 再分装 EP 管中( 每 肠液、 人 工 肠 液 中 的 相 对 剩 余 百 分 率 分 别 为
管 1mL , 每个时间点平行 3 份), 于 37 ℃ 水浴中 ( 93.23±1.55 ) % 、( 92.46±2.33 ) % 、( 82.97±
孵育不同 时 间 后 分 别 取 样 300 μ L , 加 入 冰 乙 腈 1.13 ) % 、( 77.41±0.74 ) % 。结果说明, 在碱性或
胰蛋白酶存在的条件下, DFB 相对于在酸性或胃
700 μ L 以终止反应, 涡旋混匀, 于4℃ 下14000g
离心 10 min , 取 上 清 液 过 0.22 μ m 滤 膜 后, 按 蛋白酶存在的环境中更易被降解; DFB 在碱性或
“ 1.5 ” 项下色谱条件进样分析, 记录色谱峰面积。 胰蛋白酶的条件下稳定性较差( 约下降 20% ), 而
1.6.2 SD 大鼠肠道菌群处理 在前述过夜培养 不易受酸性及胃蛋白酶的影响。
液加 入 一 定 量 的 增 溶 剂 泊 洛 沙 姆 188 , 以 增 加 2.5 DFB 在 SD 大鼠肠道菌群中的稳定性
DFB 的溶解性, 移取 1mL 培养液于 EP 管中, 分 以 0h 时 DFB 的峰面积为 100% , 计算各时
别加入 DFB 储备液 10 μ L , 涡旋混匀后置入厌氧 间点的剩余百分比, 结果见图 3 。如图所示, 经过
12h 、 37 ℃ 孵育后, DFB 在 SD 大鼠肠道菌群中
培养箱, 培养不同时间后分别取样 0.5mL 于 EP
管 中 ( 每 个 时 间 点 平 行 3 份 ), 加 入 冰 乙 腈 孵育 时 发 生 了 相 对 降 解, 但 相 对 剩 余 百 分 率 在
( -20 ℃ 预冷 2h ) 1mL 以终止反应, 12000g 离 90%上, 总体表现出稳定的趋势。结果表明, DFB
心10min , 取上清液过 0.22 μ m 滤膜后, 按“ 1.5 ” 不易受 SD 大鼠肠道菌群的影响。
项下色谱条件进样分析, 记录色谱峰面积。以培 2.6 DFB 在生物样品中的稳定性
养相同时长不含 DFB 的培养液为空白对照, 同法 以 0h 时 DFB 的峰面积为 100% , 计算各时
操作。 间点的剩余百分比, 结果见图 4 。如图所示, 经过
1.6.3 空白组织样品处理 在上清液中加入一 6h 、 37 ℃ 孵 育 后, 在 胃 液、 肝 液、 大 肠 及 其 内 容
定量的增溶剂泊洛沙姆 188 来增加 DFB 在样品 物、 小 肠 及 其 内 容 物 的 相 对 剩 余 百 分 率 分 别 为
中的溶解性。将上述制备好的上清液迅速分装到 ( 93.05±0.84 ) % 、( 95.38±0.7 ) % 、( 94.58±
EP 管中( 每管1mL , 每个时间点平行3 份), 加入 0.424 ) % 、( 84.06±0.212 ) % 。 结 果 表 明, DFB
DFB 储备液10 μ L , 混匀后置37 ℃ 水浴中孵育不 在胃液、 肝液、 大肠及其内容物中基本稳定, 但在
同时间后, 移取 300 μ L , 加入 700 μ L 冰乙腈以终 小肠及其内容物中有一定的降解( 约 16% )。
止反应, 涡旋 2 min , 14000g 离心 10 min , 取上
清液过 0.22 μ m 滤膜后, 按“ 1.5 ” 项下色谱条件 3 讨 论
进样分析, 记录色谱峰面积。 口服药物在胃肠道环境下的稳定性考察, 是
新药开发的重要研究内容, 而药物在胃肠道中的
2 结果与分析
含量变化是关键环节。本试验采用液相色谱法,
2.1 方法专属性 考察了 DFB 在人工胃 / 肠液、 肠道菌群及生物样
如图 1 所 示, 在 该 色 谱 条 件 下, DFB 能 被 检 品中的稳定性。结果发现, DFB 在空白胃液和人
出, 保留时间为 5.30min , 分离度良好, 不受其他 工胃液中有一定降解, 但 DFB 的剩余百分比均在
物质干扰。表明样品测定条件以及处理方法具有 90% 以上, 总体表现出稳定趋势。 DFB 在空白肠
专属性, 不受基质干扰。 液和人工肠液中发生降解( 约 20% ), 表明在碱性
2.2 精密度试验 或胰蛋白酶存在的条件下, DFB 相对于在酸性或
DFB 低、 中、 高 3 种 质 量 浓 度 在 不 同 时 间 点 胃蛋白酶存在的环境中更易降解。此结果与前期
测 得 峰 面 积 如 表 1 所 示。 RSD 值 为 分 别 为 的研究结果相似, 左三龄等 [ 27 ] 研究发现, DFB 在
0.1% 、 0.12% 、 0.18% , 表明仪器精密度良好。 酸性介质中稳定性较碱性条件下更为稳定。
2.3 重现性试验 鉴于进入 肠 道 的 药 物 会 受 到 肠 道 菌 群 的 影
不同样品测得峰面积见表 2 。 RSD 值分别为 响, 本研究另外测定 DFB 在 SD 大鼠肠道菌群中
0.1% 、 0.12% 、 0.18% , 表明方法的重现性良好。 的稳定性。结果显示, DFB 在 SD 大鼠肠道菌群
2.4 DFB 在人工胃 / 肠液中的稳定性 中表现出稳定的趋势, 说明肠道菌群对 DFB 几乎
以 0h 时 DFB 的峰面积为 100% , 计算各时 没有代谢作用。为了使试验条件更加接近生物体
