Page 6 - 《西北农业学报》2022年第1期

· ２ · 西 北 农 业 学 报 ３１ 卷

下基础。 挑选上调基因和下调基因各 ２ 个，使用荧光定量
ＰＣＲ （ ＲＴＰＣＲ ）进 行 表 达 量 验 证，以 犃犆犜犅 作
ｑ
１ 材料与方法
为内参，引物信息见表 １ 。对差异表达基因使用
１．１ 试验动物饲养 超几何分布进行 ＧＯ 功能富集分析和 ＫＥＧＧ 信
选用江苏省家禽科学研究所（本单位）培育的 号通路富集分析。
Ｃ３ 蛋鸡品系， ８ 周龄前常规饲养，满 ８ 周龄时选 表 １ 狇 犚犜犘犆犚 引物
取体质量相近母鸡 ８０ 只，分为 ８ 个重复，每个重 犜犪犫犾犲１ 犘狉犻犿犲狉狊犳狅狉狉犲犪犾狋犻犿犲 狇 犚犜犘犆犚
复 １０ 只。 ９～１８ 周 龄，定 量 饲 喂 代 谢 能 水 平 为 引物 序列（ ５′ → ３′ ） 产物长度／ ｂ ｐ
Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅ ｑ ｕｅｎｃｅ （ ５′ → ３′ ） Ｐｒｏｄｕｃｔｓｉｚｅ
１２．１４ＭＪ ／ ｋ ｇ 的高能饲粮， １８ 周龄后自由采食标 ＣＣＫＡＲ ｑ Ｆ ＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＧＧＴＣＣＣＴＴＴ １６７
准营 养 水 平 的 饲 粮。整 个 试 验 过 程 参 照 ＮＲＣ ＣＣＫＡＲ ｑ Ｒ ＡＡＴＧＡＡＡＴＧＡＧＧＣＣＡＴＡＣＧＣ
（ １９９４ ）标准配制试验日粮，分 ９ ～ １８ 周龄和 １９ 周 ＶＴＧ１ ｑ Ｆ ＡＣＡＴＧＣＴＡＣＴＣＣＧＴＴＧＡＣＣＣ １２７
龄后两个阶段配制，配以粉料饲喂。 ９～１６ 周龄 ＶＴＧ１ ｑ Ｒ ＴＣＴＧＣＣＡＴＴＣＣＡＡＣＡＧＧＣＴＴ
在育成鸡舍四层阶梯笼内饲养（ ５ 只／笼）， １７ 周龄 ＲＦＸ６ ｑ Ｆ ＣＡＣＴＣＣＴＴＧＣＡＧＴＣＴＣＡＧＧＡ １８７
ＲＦＸ６ ｑ Ｒ ＧＡＣＣＴＣＣＣＧＴＴＴＴＧＴＴＴＧＣＴ
起在产蛋鸡舍三层阶梯笼内饲养（ １ 只／笼）。整
ＣＥＴＰ ｑ Ｆ ＡＧＴＣＴＣＧＣＣＣＴＴＣＣＴＧＡＧＡＴ １４９
个试验期间，所有鸡只可以自由饮水，并执行常规
ＣＥＴＰ ｑ Ｒ ＧＣＡＧＣＴＴＧＧＡＴＡＧＴＧＡＣＣＧＴ
光照和免疫等程序。
ＡＣＴＢ ｑ Ｆ ＣＡＣＧＧＴＡＴＴＧＴＣＡＣＣＡＡＣＴＧ ２００
１．２ 犚犖犃狊犲 狇 高通量测序 ＡＣＴＢ ｑ Ｒ ＡＣＡＧＣＣＴＧＧＡＴＧＧＣＴＡＣＡＴＡ
以 ２０ 周龄作为开产早晚的界限，开产鸡均为
１９ 周龄开产，未开产鸡均在 ２０ 周龄末仍未开产， ２ 结果与分析

２０ 周龄末每个重复选取 １ 只开产鸡和 １ 只未开 ２．１ 蛋鸡肝脏的测序质量
产鸡，称体质量后各取最接近平均值的 ３ 只，未开
未开产与开产蛋鸡的肝脏经过 ＲＮＡｓｅ ｑ 测
产鸡分别为 Ｎ１ 、 Ｎ２ 、 Ｎ３ ，开产鸡分别为 Ｒ１ 、 Ｒ２ 、 序，得到转录组原始序列。表 ２ 为测序数据的初
Ｒ３ ，屠宰并取出肝脏组织，放入液氮中保存。 步分析，可见， ６ 个样品测得的原始序列经质量过
使用 ＴＲＩｚｏｌ试剂提取肝脏组织总 ＲＮＡ ，使
滤后，纯净序列仍超过 ８０００００００ 个，占原始序列
用琼脂糖电泳和 Ａ ｇ ｉｌｅｎｔ２１００ 检测 ＲＮＡ 质量。 的 ９９％ 以上，说明低质量的序列少，测序效果较
利用 ｒＲＮＡ 去除试剂盒去除 ｒＲＮＡ ，并通过离子 好。开产鸡与未开产鸡的原始序列和纯净序列数
打断的方式将 ＲＮＡ 打断成 ２００ ～ ３００ｂ ｐ 的片段。
量均相当，说明两组测序质量相近。
ＲＮＡ 经过反转录形成 ｃＤＮＡ ，再经 ＰＣＲ 富集构 将各样品的纯净序列与鸡参考基因组比对，
建 ｃＤＮＡ 文库，该文库通过荧光定量检测其大小 由统计比对上的序列（表 ３ ）可见， ６ 个样品能比
和浓 度，上 机 至 Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｎｅｘｔｓｅ ｑ ５００ 平 台 进 行
对到基因组的序列均占纯净序列的 ８０％ 左右，且
测序。 绝大部分是基因序列，约 ９０％ ，外显子序列在基
１．３ 序列分析 因序列中所占比例也很高，均占 ８０％ 左右。以上
下机得到原始数据，经过 ｒｅａｄｓ 数、 Ｑ２０ 、 Ｑ３０ 结果表明 ６ 个样品测序结果均较好，得到的序列
等初步统计，经碱基质量分布检测后去除接头，进
基本为有效的基因序列，可进行后续研究。
行质量过滤，得到 ｃｌｅａｎｒｅａｄｓ 和 ｃｌｅａｎｄａｔａ 。这 表 ２ 测序数据初步分析
些数据使用 Ｔｏ ｐ ｈａｔ２ 与鸡参考基因组进行比对， 犜犪犫犾犲２ 犘狉犲犾犻犿犻狀犪狉 狔 犪狀犪犾 狔 狊犻狊狅犳犚犖犃狊犲 狇犱犪狋犪
统计比对到外显子、内含子和基因间区的 ｒｅａｄｓ 。 样品 原始序列 纯净序列 纯净序列／原始序列／ ％
Ｓａｍ ｐ ｌｅ Ｒａｗｒｅａｄｓ Ｃｌｅａｎｒｅａｄｓ Ｃｌｅａｎｒｅａｄｓ ／ Ｒａｗｒｅａｄｓ
比对结果使用 ＲＳｅＱＣ 进行插入片段长度分布、
Ｎ１ ８３２３７９４４ ８２５９７２６４ ９９．２３
ｒｅａｄｓ 重复率等质控分析。
Ｎ２ ８１９４３３３６ ８１２６４２３４ ９９．１７
比对到各基因的 ｒｅａｄｓ 使用 ＨＴＳｅ ｑ 统计，得
Ｎ３ ８３５４３８４２ ８２７２８９２４ ９９．０２
到各基因的原始表达量，开产鸡和未开产鸡的表
Ｒ１ ８３２７６１１６ ８２５８５３９０ ９９．１７
达量经过 ＲＰＫＭ 标准化后，再使用 ＤＥＳｅ ｑ 分析
Ｒ２ ８１０８９３８８ ８０３４８４３８ ９９．０８
其差异性，按照表达量倍数差异（ ｆｏｌｄｃｈａｎ ｇ ｅ ） ＞
Ｒ３ ８０７３０７５４ ８０３８３１９６ ９９．５６
２ 、差异显著性 犘 ＜０．０５ 筛选出差异表 达 基 因。