Page 6 - 《西北农业学报》2022年第5期
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·  5 3 6 ·                        西   北   农   业   学   报                                31 卷

              生物多样性保护以及间充质干细胞在野生濒危物                           中, 加入 10 mL 的 含 20% FBS 的 DMEM 培 养
              种中的应用研究提供依据。                                    基, 在 37 ℃ , 5% CO 2 饱和湿度条件下培养 7d ,
                                                                                 ,
             1 材料与方法                                          期间2d更换1 次培养基。原代细胞生长至80%
                                                              左右时传代。用 0.25% 胰蛋白酶和 0.04% ED-
             1.1  试验材料                                        TA 消 化, 含 10% FBS 的 DMEM 中 和, 1000
             1.1.1  动物材料   动物样品采自楼观台珍稀野                      r / min 离心 3 min 后弃上清, 加入新鲜培养基制
                                                                                                6
              生动物抢救饲养研究中心( 陕西省西安市周至县)                         成单细胞悬液。将 1mL 浓度为 1×10 mL               -1  的
             12 岁正常死亡 6h 后的雄性羚牛。将无菌分离                         细胞悬液置于直径10cm 的培养皿中, 加入9mL
              的羚牛股骨用含青霉素 - 链霉素的磷酸缓冲液洗                         DMEM 和 10% FBS 培养至 80% 融合度时冷冻
              涤 3 次, 4 ℃ 保存, 备用。本研究涉及的所有动物                    保存, 冻存时间不超过 3 代         [ 21 ] 。
              试验程序均已获得西北大学实验动物伦理委员会                          1.2.2  染色体组型分析   用 0.3 μ g mL 的秋水
                                                                                              /
              批准[ 许可证号: SYXK ( 陕) 2021-004 ]。                 仙素处理羚牛骨髓间充质干细胞 6h 。细胞经胰
                                                              蛋白酶 ( 0.25% 胰 蛋 白 酶, 0.04% EDTA ) 消 化
             1.1.2  试剂与仪器   试剂: 胎牛血清( Fetalbo-
             vineserum , FBS )、 高糖培养基( Dulbecco ’ smod-       后, 加入低渗溶液( 0.075mol / LKCl ) 重悬, 37 ℃
             ififiedEa g lemedium , DMEM )、 胰岛素 - 转铁蛋         处理 30min后离心去上清。加入固定液( 甲醇 ∶
              白 - 硒 ( Insulin-Transferrin-Selenium , ITS )、 胰  冰醋酸 =3∶1 , 体积比) 固定细胞 3 次, 制成细胞
              岛素( Insulin , IS )、 胰蛋白酶( Gibco ); 乙二胺四乙        悬液。 将 细 胞 悬 液 滴 至 高 度 大 于 10 cm 的
              酸( Eth y lenediaminetetraaceticacid , EDTA )、 吉  -20 ℃ 预冷载玻片上, 风干后用染色液( Giemsa
              姆萨染液( Giemsastainsolution )、 3- 异丁基 -1- 甲       ∶PBS=1∶9 ) 染色    [ 22 ] 。显微镜下观察染色体形
              基黄嘌呤( 3-Isobut y l-1-meth y lxanthine , IBMX )、  态并进行组型分析。

              地塞米 松 ( Dexamethasone , DM )、 吲 哚 美 辛 ( In-    1.2.3  细胞表面抗原鉴定   采用流式细胞技术
             dometacin , ID )、 抗 坏 血 酸 ( Ascorbicacid , AA )、  对骨 髓 间 充 质 干 细 胞 表 面 抗 原 进 行 鉴 定       [ 23 ] 。
              秋水仙素( 北京索莱宝科技有限公司); 转化生长                       0.25% 胰 蛋 白 酶 消 化 细 胞, 10% FBS 中 和 培 养
              因子 3 ( Transformin gg rowthfactor- β 3 , TGF-   基, PBS 洗涤3 次。用移液器反复吹打, 获得均匀
                  β
             β 3 )、 - 甘 油 磷 酸 酯 ( -Gl y cero p hos p hate , -GP )、  细胞 悬 液。将 细 胞 稀 释 至 浓 度 为 0.5~1×10    6
                 β
                               β
                                                  β
              油红( OilRedO )、 茜素红( AlizarinRedS )、 阿利          mL -1  后用 2% PFA 固定细胞 20min , PBS 洗涤
              新蓝( Alcianblue )、 胰蛋白酶( Si g maAldrich ); 多    3 次, 采 用 以 下 抗 体 进 行 流 式 细 胞 免 疫 反 应:
              聚甲醛( PFA )、 氯 化 钾、 无 水 乙 醇、 甲 醇、 冰 醋 酸         CD14-FITC ( Fluoresceinisothioc y anate ), CD19-
              ( 上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。                            FITC , CD34-FITC , CD45-FITC , HLA-DR-
                  仪器: 超净工作台( 北京昊诺斯科技有限公司                     FITC , CD105-PE ( h y coer y thrin ), CD166-PE ,
                                                                               p
             ECO0.9 ), 高温高压灭菌锅( 上海赛默生物科技                     CD44-PE , CD73-PE , CD90-PE ( 表 1 )。使用安装
              发展公司 SX-300 ), 体视显微镜( 上海舜宇恒平科                  FACSCom p 软件的 FACSCalibur流式细胞仪进
              学仪器有限公司 S10 ), 二氧化碳培养箱( 恒生实                     行分析。
              验 设 备 有 限 公 司 CHP-80Q ), 倒 置 荧 光 显 微 镜         1.2.4  骨髓间充质干细胞的定向分化培养   细
              ( Nikon ), 医用冷藏箱( 厦门蓝冰生物科技有限公                   胞的成脂分化培养         [ 24 ] : 将 P3 代间充质干细胞消
                                                                                              4
              司 QBLL0812 ), -20℃ 冰箱( 海尔 DW-25L256 ),          化处理制成单细胞悬液。将 8×10 个细胞接种
              -80 ℃ 冰箱( 赛默飞世尔科技公司 ULTS1490 ),                 于直径 3.5cm 的培养皿中培养 24h 。随后将培
              流式细胞仪( BDBiosciencesFACSAriaTMIII ),            养基替 换 为 成 脂 分 化 培 养 基 ( 含 10% FBS 的
              高速离心机( 赛默飞世尔科技公司 H1850 )。                       DMEM , 500 μ mol / LIBMX , 1 μ mol / L DM , 10
             1.2  试验方法                                       μ mol / LIS , 200 μ mol / LID ) 进行定向诱导培养,

             1.2.1  羚牛骨髓间充质干细胞的分离与培养                          期间每周更换 2 次培养基。 21d 后, PBS 冲洗 2
              无菌条件下分离死亡羚牛股骨, 去除附着在骨头                          次, 4% PFA 固定 10 min 。用染色液( 0.3% Oil
              上的所有结缔组织, 用套管针连接 10mL 注射器                       RedO 溶 于 60% 异 丙 醇) 处 理 细 胞 20 min 后,
              抽吸骨髓。抽吸后将骨髓置于直径10cm 培养皿                        60% 乙醇漂洗 2 次, 在倒置荧光显微镜下观察细
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