Page 6 - 《西北农业学报》2022年第7期

· 8 0 6 · 西 北 农 业 学 报 31 卷

Marker 、 2×Ta q DNA 聚 合 酶 购 自 宝 生 物 工 程 果判定标准进行判定。用于检测的抗生素有 21
( 大连) 有限公司。 种, 包括阿莫西林、 氨苄西林、 头 孢 呋 辛、 头 孢 噻
1.2 方 法 呋、 头孢西丁、 青霉素、 庆大霉素、 链霉素、 红霉素、
1.2.1 病原菌的分离培养与染色镜检 将无菌 克拉霉素、 多西环素、 左氧氟沙星、 诺氟沙星、 恩诺
采集的病料分别划线接种至鲜血固体培养基上, 沙星、 环丙沙星、 磺胺异恶唑、 磺 胺 嘧 啶 钠、 利 福
37 ℃ 培养 18h 后, 挑取疑似单菌落进行纯化培 平、 克林霉素、 土霉素和四环素。
养, 观察分离菌的生长状态并挑取单菌落进行革 1.2.4 16SrRNA 的 PCR 扩增与分析 挑取分
兰氏染色。显 微 镜 观 察 细 菌 的 染 色 及 形 态 学 特 离菌纯培养单菌落接种于肉汤培养基, 37 ℃ 培养
征。 并收集菌体, 采用细菌基因组 DNA 提取试剂盒
1.2.2 生化试验 将分离菌加入细菌微量生化 提取基因组 DNA 。用 表 1 引 物 进 行 16SrRNA
反应管中37℃ 恒温培养18~24h , 观察颜色变化 基因的 PCR 扩增。 PCR 扩 增 体 系( 25 μ L ): 上、
并记 录 结 果。根 据 《 链 球 菌 生 化 编 码 鉴 定 手 册 下游引物各 1 μ L 、 2×Ta q Mix12.5 μ L 、 ddH 2O

( GYZ-12St )》 对分离菌进行初步鉴定分析。 8.5 μ L 、 模板 2 μ L 。 PCR 反应条件: 95 ℃ 预变性
1.2.3 药物敏感性试验 采用纸片扩散法, 将分 5min ; 95 ℃ 变性 30s , 56 ℃ 退火 30s , 72 ℃ 延伸
离菌菌液均匀涂布于 MH 固体培养基表面, 将含 90s , 35 个循环; 72℃ 延伸10min 。 PCR 产物经
有抗生素的药敏片贴放于培养基表面, 37 ℃ 培养 电泳检测回收后进行测序。测序结果通过 Blast

18h 后 测 量 抑 菌 圈 直 径, 重 复 3 次, 记 录 数 据。 与 GenBank 中马链球菌相关参考序列进行比对,
依据临床和实验室标准化委员会( CLSI ) 药敏结 利用 DNAStar软件构建系统发育树。
表 1 引物信息
Table1 Primerinformation
基因 引物序列( 5'→3' ) 预计扩增片段长度 / b p
Gene Primerse q uence ( 5'→3' ) Pro j ectedam p lificationfra g mentlen g th

SeM F : TCTTTGCGTTTAGGAGACA 1500
R : AGCATCAGAAAACTAAGTGC
F : AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
16SrRNA 1000
R : ACCTGTCACCCGATGTACCG AAGTA
1.2.5 SeM 基因的 PCR 扩增与分析 基因组 或链状分布的革兰氏阳性球菌( 图 2 )。
DNA 提取 方 法 同 “ 1.2.4 ”。 用 表 1 引 物 进 行
SeM 基因的 PCR 扩增。 PCR 扩增体系( 25 μ L ):
上、 下游引物各1 μ L 、 Ta qDNA 聚合酶12.5 μ L 、
ddH 2O8.5 μ L 、 模板2 μ L 。反应条件为: 95 ℃ 预

变性5min ; 94℃ 变性30s , 45℃ 退火45s , 72℃
延伸 105s , 35 个循环; 72 ℃ 延伸 10 min 。 PCR
产物经 电 泳 观 察 后, 将 目 的 条 带 回 收 并 测 序。
SeM 基因测序结果在 PubMLST-seM 数 据 库 中
比对进行 SeM 基因型的鉴定, 与该库中马链球菌
图 1 分离菌在鲜血琼脂培养基上形成的菌落形态
马亚种其他相关序列进行 blast比对分析并构建
Fi g .1 Colon ymor p holo gy ofisolatedbacteria
系统发育树。
formedonbloodAGAR medium
2 结果与分析 2.2 生化试验
将分离菌分别接种于生化反应管, 经培养后
2.1 分离菌的形态学特征 菌株 Z422 与 JMC111 均 可 发 酵 吡 咯 烷 酮、 精 氨
从病样中分 离 到 2 株 疑 似 菌, 分 别 命 名 为: 酸、 甲基丙烯酰基、 髓磷脂连接 糖、 曲 美 他 嗪、 蔗
Z422 和JMC111 。 2 株分离菌在鲜血琼脂培养基 糖, 不能发酵二苯基膦、 七叶苷、 葡磷、 蕈糖、 山梨
上生长良好, 菌落周围出现透明的溶血圈( 图 1 )。 醇, 初步判定分离菌为马链球菌, 生化反应结果见
革兰氏染色后, 显微镜下观察可见蓝紫色的单个 表 2 。